Zur Genauigkeit der Lokalisierung immobiler und mobiler submikroskopischer Partikel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildanalyse

Diplomarbeit aus dem Jahr 1997 im Fachbereich Physik - Biophysik, Note: 1,7, Universität Münster (Institut für Medizinische Physik und Biophysik), Sprache: Deutsch, Abstract: [...] Eine der effektivsten Möglichkeiten, die genauen Transportmechanismen zu untersuchen, besteht darin, die Trajektorien einzelner Moleküle und Partikel während des Transportes in lebenden Zellen direkt zu visualisieren und quantitativ auszuwerten [Gosh und Webb, 1994; Schmidt et al, 1995; Schütz et al. 1997; Saxton, 1997]. Dies erfordert Untersuchungsmethoden, die keinen Einfluß auf die Struktur und Funktion einer Zelle haben, aber dennoch in der Lage sind , diese real abzubilden und zu analysieren. Das konfokale-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) stellt eine solche nichtinvasive Technik dar, die es erlaubt dreidimensionale, komplexe biologische Proben in vielfältiger Weise, auch mit realer dreidimensionaler Auflösung, abzubilden und zu analysieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die Möglichkeiten eines konventionellen CLSM im Hinblick auf die Detektion von Trajektorien mobiler submikroskopischer Partikel und Moleküle zu definieren.
Die Größe der betrachteten Moleküle und Partikel liegt deutlich unterhalb der Wellenlänge des Lichtes. Das Bild der submikroskopischen Teilchen ist daher eine Airy-Scheibe mit einem Radius von ca. 200 nm, je nach Apertur des Objektivs. Dadurch ist das Auflösungsvermögen des Mikroskopes begrenzt, d.h. Strukturen, die näher zusammenliegen als der Radius der Airy-Scheibe können nicht mehr getrennt dargestellt werden.
In dieser Arbeit wird nun die Tatsache ausgenutzt, daß die Position des Zentrum einer einzelnen Airy-Scheibe - und damit die Position des abgebildeten Partikels - mit einer Genauigkeit lokalisiert werden kann, die weit unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskopes liegen kann. Die Position des Zentrums wird dabei durch einen Fitprozeß bestimmt. Anhand einer statistischen Analyse dieser Fit-Methode wird ein theoretisches Modell entwickelt, das Voraussagen über die Lokalisierungsgenauigkeit des Zentrums erlaubt. Dabei zeigt sich, daß die theoretische Lokalisierungsgenauigkeit nicht nur von den gewählten Aufnahmeparametern (z.B. Objektiv und Bildfeldgröße), sondern maßgeblich vom erzielbaren Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) der Bilder anhängt.
Daher wird ein Überblick über die vorhandenen Rauschquellen des verwendeten Mikroskopes gegeben und ein Modell entwickelt, das eine genaue Definition des SRV zuläßt. Diese Methode wird durch entsprechende Messungen des Rauschens ergänzt und überprüft. [...]